Engenharia Genética - principais técnicas...

A Engenharia Genética é um conjunto de técnicas que permite aos cientistas identificar, isolar e multiplicar genes de quaisquer organismos. Estas técnicas incluem a cultura de células, o uso de isótopos radioactivos, a clonagem molecular, a tecnologia do DNA recombinante e o aperfeiçoamento de várias técnicas com enzimas. O objectivo é introduzir novas características em indivíduos, para seu próprio proveito ou para servir outros organismos. São exemplos disso:

• a modificação do genoma de uma planta tornando-a resistente a um herbicida;


• o isolamento, extração e o enxerto de gene humano para a produção de insulina em bactérias da espécie Escherichia coli, que, contendo o gene humano, multiplicam-se quando cultivadas em laboratórios, produzindo insulina, o que actualmente é realizado em grande escala

Falando de Enzimas...

A descoberta das enzimas de restrição foi um dos contributos de maior importância para o desenvolvimento da Engenharia Genética. Estas são consideradas a primeira "ferramenta" da Engenharia Genética.

A função destas enzimas, e perceber-se-á a sua elevada importância, é cortar a cadeia dupla de DNA em zonas específicas, cada vez que as encontram.

Os vírus invadem frequentemente as bactérias e afectam o seu DNA. Algumas bactérias têm como mecanismo de defesa as endonucleses de restrição, ou seja, as enzimas que cindem a cadeia dupla de DNA (no sentido 5'-3') sempre que encontram uma determinada sequência de pares de bases - zonas de restrição. ( Portanto, cada tipo de enzima de restrição corta uma região específica do DNA.) Estas enzimas procedem, assim, à fragmentação do DNA viral, desactivando-o.

Estas enzimas, como já foi dito, cortam o DNA sob a forma de hélice dupla, com uma extensão em cada uma das extremidades de DNA em cadeia simples - extremidades coesivas.

Estas extremidades coesivas podem ligar-se, por complementaridade, a outro DNA. Neste processo intervêm as DNA ligases que catalizam o processo de ligação de DNA.

Com a descoberta das enzimas de restrição e das DNA ligases os cientistas tinham ao seu dispor todo o material necessário para transferir genes de uma molécula de DNA para outra, e consequentemente de um organismo para outro.

Necessitavam apenas de um elemento de transferência do material genético de um genoma para outro - vector.

Vetores utilizados em Engenharia Genética

Plasmídeo bacteriano

As bactérias, em particular a Escherichia coli, constituem um dos principais materiais biológicos empregados nas técnicas da Engenharia Genética. Isto deve-se a vários fatores:
- ciclo de vida rápido em relação aos organismos superiores;
-cultivo de um grande número de indivíduos num espaço pequeno;
- apresenta menor número de genes em relação aos organismos superiores;
- divisão celular por bipartição.
Além do DNA cromossómico, a célula bacteriana contém pequenas moléculas de DNA circular denominadas plasmídeos. Estes mantêm uma existência independente do DNA essencial à vida da bactéria; no entanto, a sua duplicação é sincronizada com a da bactéria, garantindo assim sua transmissão para as bactérias-filhas.
Em Engenharia Genética, genes "estranhos" na bactéria podem ser incorporados nos seus plasmídeos, e assim, tais bactérias passam a produzir as proteínas que esses genes codificam.
Certos plasmídeos possuem genes responsáveis pela síntese de enzimas que destroem um antibiótico antes mesmo que ele faça mal a bactéria.
Os plasmídios portadores de genes que conferem resistência a drogas são chamados PLASMÍDEOS R (R Resistência). Eles possuem também, genes que permitem a sua passagem de uma bactéria para outra (RTF ou Fator de Transferência de Resistência).
Quando dois ou mais tipos de plasmídios R estão presentes numa mesma bactéria, os genes de um deles podem passar para o outro. Esse mecanismo faz com que surjam plasmídios R muito complexos, portadores de diversos genes para resistência a diferentes antibióticos.

Vírus

Os vírus, principalmente o bacteriófago, são de grande utilidade na Tecnologia do DNA Recombinante.
O bacteriófago possui genes essenciais que são indispensáveis à reprodução, e também genes não essenciais, cuja presença é dispensável à multiplicação viral. Os genes essenciais produzem as proteínas da cápsula e as enzimas que actuam na duplicação do DNA viral. Esses genes estão localizados nas extremidades do cromossoma do vírus. Entretanto, os genes não essenciais estão relacionados com os processos de recombinação entre moléculas de DNA, e localizam-se na região mediana do cromossoma viral, sem interferir na reprodução do vírus, sendo portanto dispensáveis.

A região mediana do cromossoma, onde se localizam os genes dispensáveis, pode ser retirada e substituída por um pedaço de DNA de outro organismo. Sendo assim, quando o cromossoma viral se multiplica, o DNA estranho incorporado a ele também será multiplicado.
Os cientistas têm utilizado essa técnica para conseguir a multiplicação de genes importantes a fim de obter grande número de cópias, o que é necessário ao estudo de genes.

Lipossomos

São essencialmente esferas de membrana sintética formadas por camadas bilipídicas preenchidas com DNA. Eles fundem-se espontaneamente com a membrana celular, liberando o seu conteúdo no citoplasma. Apresentam a vantagem de nunca causar doença alguma, porém apresentam pouca eficiência.

Técnica do DNA Recombinante

Em Engenharia Genética a expressão DNA Recombinante designa o resultado obtido a partir de pedaços de DNA de fontes diferentes ligados entre si. Às vezes, o DNA provém de dois organismo diferentes, como é o caso do gene para insulina ligado ao DNA da bactéria. Outras vezes, um pedaço de DNA de um organismo pode ser ligado a um DNA sintético produzido em laboratório pela junção de nucleótidos na sequência desejada.
Para se conseguir DNA recombinante é preciso cortar as moléculas de DNA que se quer recombinar e em seguida, "colar" as suas extremidades. Para isso, os pesquisadores contam com ferramentas extremamente úteis: enzimas de restrição. Essas enzimas são obtidas de bactérias que as produzem naturalmente para se defenderem da invasão de alguns vírus.

1º passo: obter genes para o enxerto pretendido, para isso pode-se:

• criar uma biblioteca de genes, que consiste no armazenamento de um grande número de fragmentos de DNA do genoma que são armazenados em vectores;


• fabricar o gene em laboratório a partir de RNA mensageiro (técnica do DNA complementar*);


• sintetizar o gene, nucleótido por nucleótido. Isso é feito normalmente para genes que codificam polipeptídeos ou proteínas de pequeno tamanho. Suponha-se que se conhece a sequência de aminoácidos de um pequeno polipeptídeo. Cada aminoácido é codificado por uma sequência de três nucleótidos de DNA - codão. Basta utilizar a tabela do código genético já conhecida para ser possível construir uma sequência de nucleótidos que corresponda exactamente à sequência de aminoácidos da proteína.

2º passo: acção das enzimas de restrição, isolando o gene que se pretende manipular.

3º passo: incorporação do gene num vector, utilizando-se o mesmo tipo de enzima de restrição utilizado no passo anterior, ma agora no vector.

4º passo: inserção do vector numa célula bacteriana.

5º passo: verificação do resultado. No caso da bactéria absorver o DNA recombinante poderão obter-se imensas cópias - clones - desta.

*Técnica do DNA complementar (cDNA)

Consiste na produção de uma molécula de DNA (cadeia simples) tendo como molde uma molécula de mRNA matura, por complementaridade de bases.

A produção do cDNA é possível por acção da enzima transcriptase reversa. O mRNA é molde para a síntese de uma cadeia de DNA, o processo inverso do que ocorre habitualmente na transcrição.

Após a formação da primeira cadeia de cDNA, a DNA polimerase forma a cadeia complementar, constituindo-se uma cadeia de DNA em dupla hélice, estável.

Curiosidade:

A comparação entre o cDNA (sem intrões) e o DNA original permite localizar as regiões codificantes (exões) e as não codificantes (intrões) de um determinado gene.

O cDNA facilita a produção de proteínas de seres eucariontes em bactérias, uma vez que estas não posuem mecanismos de processamento do mRNA, isto é, em presença de um DNA original transcreveriam todo o gene, incluindo os intrões, obtendo-se proteínas diferentes das que se pretendiam.

Ao ser inserido um clone de cDNA garante-se a produção da proteína normal.

Fontes:

SILVA, Amparo Dias da; SANTOS, Maria Ermelinda; MESQUITA, Almira Fernandes; BALDAIA, Ludovina; FÉLIX, José Mário; Terra, Universo de Vida; Porto: PortoEditora, 2009.

Engenharia Genética, 19/01/2010 < http://www.scribd.com/doc/1025855/Engenharia-Genetica>

Engenharia Genética - Tecnologia do DNA, 19/01/2010 < http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/dna/engenharia-genetica.php >

A Biologia e os Desafios da Actualidade, 19/01/2010 < http://www.biologia-ap.no.comunidades.net/index.php?pagina=1288163696>

A palavra assusta, é dura. Facto explicável apenas pela carga emocional, pelo peso do medo, pelo horror da proximidade que cada um de nós associa a esta pequena palavra - cancro.

Aqui não se pretendem abordar os sentimentos ou as viências de alguém que conviva com um cancro, pretende-se sim explicar, na teoria, o porquê de estas "pedras no caminho" de tanta gente aparecerem assim, tanto e sem aviso.

Proto-oncogenes -> genes que estimulam a divisão celular e participam activamente na regulação da proliferação e diferenciação das células.

Oncogenes -> genes que foram alterados por acção de agentes mutagénicos (de origem química, física ou biológica) - mutados - e que por passarem a estimular continuamente a divisão celular podem conduzir à formação de um tumor.

Genes supressores tumorais -> comparativamente aos proto-oncogenes são genes intimamente ligados à divisão celular, no entanto com função contrária - inibindo a divisão celular. Estes genes podem sofrer mutações e perder a sua função, descontrolando-se assim a divisão das células.

Mas afinal como aparecem?

Todos os cancros são genéticos, pois todos resultam de alterações no material genético do indivíduo, no entanto, cancros hereditários são muito poucos.

A acumulação de mutações leva à formação do tumor, que se estende aos tecidos circundantes devido ao descontrole da divisão celular - metastase.

A maioria dos cancros são cancros esporádicos, que surgem como resultado de mutações somáticas (devidas a agentes mutagénicos externos).

Fontes: SILVA, Amparo Dias da; SANTOS, Maria Ermelinda; MESQUITA, Almira Fernandes; BALDAIA, Ludovina; FÉLIX, José Mário; Terra, Universo de Vida, Porto: PortoEditora, 2009

À distância de um cromossoma

A Trissomia 21, ou Síndrome de Down, é uma alteração genética, que ocorre durante a divisão das células do embrião.

O indivíduo com Trissomia 21 possui 47 cromossomas (e não 46), sendo o cromossoma extra ligado ao par 21.

Intimamente ligada a um excesso de material cromossómico, este distúrbio no cariótipo do embrião tem nítida relação com a idade dos pais.

As estatísticas dizem-nos que um em cada 800 a 1000 recém-nascidos são portadores de trissomia 21, um distúrbio genético causado pela presença de três cópias do cromossoma 21 em vez do habitual par de homólogos.

A Síndrome de Down está normalmente associada a dificuldades no âmbito do desenvolvimento físico e das capacidades cognitivas, assim como a diferenças na aparência facial e corporal.

Enquanto no início da década de trinta, a esperança de vida para uma pessoa com trissomia 21 era de nove anos, hoje pode ter uma vida longa e saudável.

Algumas das características dos portadores de Síndrome de Down são: a prega palmar transversa (uma única prega, em vez de duas), olhos com formas diferenciadas devido às pregas nas pálpebras, membros pequenos, pescoço curto e largo e língua exposta.

Os afectados pela síndrome de Down possuem maior risco de sofrer defeitos cardíacos congénitos, otites recorrentes, apneia de sono obstrutiva e disfunções da glândula tiróide, entre outras.

Como é possível que depois de todas estas "condicionantes genéticas" ainda existam o preconceito e a vergonha por parte da sociedade a atormentar a vida destas pessoas?
Afinal, têm apenas mais um cromossoma que o comum, o cromossoma do AMOR como tantas vezes é descrito... Sejamos pessoas.


Fontes:

• SILVA, Amparo Dias da; SANTOS, Maria Ermelinda; MESQUITA, Almira Fernandes; BALDAIA, Ludovina; FÉLIX, José Mário; Terra, Universo de Vida, Porto: PortoEditora, 2009

• Trissomia 21, 13/01/2009

Alterações (in)contornáveis

• O fenótipo dos indivíduos é o resultado da interacção genoma - ambiente.
  

• A célula tem capacidade para reparar anomalias que afectam o DNA mas algumas presistem e alteram o genoma.
  

• Então, devido a variados factores, o genoma dos individuos sofre alterações, que se denominam mutações.
  

• Muitas vezes estas mutações ocorrem de forma espontânea como resultado de agentes mutagéncos internos ou externos ao organismo.

• Tendo em conta que os milhões de células que constituem o nosso organismo estão em constante divisão, admite-se que a possibilidade de erro durante algum dos processos decorrentes da vida celular é elevadíssimo. Este facto seria uma fatalidade não tivessem as células, como já referido, uma extraordinária capacidade para reparar estas anomalias (aliada ainda às mutações silenciosas).
  

Mutações Génicas -> envolvem uma alteração pontual ao nível dos nucleótidos de um gene.

Existem três tipos de mutações génicas, estas são ilustradas pelas seguintes imagens:

Mutações Cromossómicas -> envolvem a estrutura ou o número de cromossomas de um indivíduo.

As mutações cromossómicas dividem-se em dois tipo: estruturais e numéricas. Nas mutações cromossómicas estruturais têm-se:













Nas mutações cromossómicas numéricas constam da alteração do número normal de cromossomas no indivíduo.



Euploidia: o cariótipo apresenta o número de cromossomas característico.


Aneuploidia: o cariótipo, num determinado par de homólogos apresenta irregularidades, por excesso ou defeito, no número de cromossomas.


Poliplodia: todo o conjunto de cromossomas é multiplicado.


Fontes: SILVA, Amparo Dias da; SANTOS, Maria Ermelinda; MESQUITA, Almira Fernandes; BALDAIA, Ludovina; FÉLIX, José Mário; Terra, Universo de Vida, Porto: PortoEditora, 2009

Regulação do material genético

Operão??!

Em 1961, François Jacob e Jacques Monod propuseram o Modelo do Operão como principal mecanismo de controlo da expressão dos genes em bactérias.

Operão é então a unidade funcional constituída pelos seguintes elementos:
Genes estruturais: conjunto de genes que codificam proteínas com funções relacionadas, como, por exemplo, as várias enzimas de uma determinada via metabólica.
Gene promotor: sequência específica de nucleótidos do DNA à qual se liga a RNA polimerase e onde tem início a transcrição.
Gene operador: sequência de DNA que controla o acesso da RNA polimerase ao promotor e que permite activar ou desactivar a transcrição de todos os genes estruturais.
Gene Regulador: encontra-se a uma determinada distância do operão, tem o seu próprio promotor e codifica o repressor.
Repressor: proteína alostérica com duas formas, uma activa e uma inactiva. É específico, reconhece e liga-se apenas ao operador de um determinado operão.

A transcrição dos genes estruturais do operão origina uma longa molécula de mRNA. Este mRNA tem sinais de iniciação e de paragem que permitem individualizar as diferentes proteínas.

Tipos de regulação dos genes em procariontes:

Regulação negativa: o operão é bloqueado pela forma activa do repressor. A ligação do repressor activo ao operador impede a ligação da RNA polimerase ao promotor e inibe a transcrição.

Operão repressível:
O repressor é sintetizado na forma inactiva, com pouca afinidade para o operador, o que permite a transcrição dos genes estruturais. O produto final da via metabólica funciona como co-repressor e, quando a sua quantidade aumenta, liga-se ao repressor e activa-o. O repressor activo liga-se ao operador e bloqueia a transcrição. Quando a quantidade do produto final diminui, a transcrição é retomada.
Processo de regulação característico de vias anabólicas que sintetizam produtos essenciais a partir de percursores. A suspensão da transcrição de genes que codificam um produto presente no meio em quantidade suficiente permite poupar recursos e energia, sendo essencial para a resposta à variação das condições ambientais e adaptação evolutiva.
Ex: Operão trp em E.coli.

Operão indutível:
O repressor é sintetizado na forma activa e liga-se ao operador, bloqueando a transcrição dos genes. Um indutor inactiva o repressor e induz a transcrição dos genes.
Processo de regulação característico de vias catabólicas. Genes que codificam enzimas são apenas transcritos se o substrato estiver presente.
Ex: Operão lac em E.coli.

Regulação positiva: uma proteína reguladora, o regulão, estimula directamente a expressão dos genes
O regulão é activado pela ligação de uma molécula específica. Na sua forma activa, liga-se a um local a montante do promotor, facilitando o acesso da RNA polimerase ao promotor e induzindo a transcrição.
Um mesmo regulão actua em diferentes operões.

Regulação em Eucariontes
Apenas uma pequena parte do genoma dos eucariontes é ocupada por genes que codificam proteínas. No entanto, o número de proteínas produzidas pelos eucariontes excede largamente o número de genes. Este facto pode ser explicado tendo em consideração o seguinte:
os exões codificam sequências de aminoácidos, designadas domínios, que podem fazer parte de mais do que uma proteína. Diferentes combinações de exões formam diferentes proteínas;
sequências de DNA, que funcionam como intrões num determinado contexto, podem funcionar como exões e codificar proteínas num contexto diferente.


A maioria do material genético de uma célula não se expressa, encontrando-se reprimido.
Este controlo da expressão genética está na origem da diferenciação celular, permitindo que só os genes específicos de um tecido sejam expressos nas células que o compõem. Assim, a expressão génica é o principal factor que determina as características estruturais, funcionais e comportamentais de uma célula, sendo a responsável pela ontogenia celular (história do desenvolvimento de um organismo ao longo da sua vida).
Numa dada célula, um gene pode exprimir-se só em determinados estádios de desenvolvimento ou em resposta a factores externos, como a modificação das condições ambientais.

Acção do Operão da lactose em procariontes (regulação em resposta a factor externo):

Num meio pobre em lactose, as moléculas de -galactosidase (enzima que degrada a lactose) que existem no interior de uma célula de E. coli são em número reduzido.
Depois de se adicionar lactose ao meio, a célula rapidamente produz esta enzima, em grandes quantidades, para a sua degradação.
Quando a produção de -galactosidase é induzida, são produzidas mais duas enzimas: uma permease e uma transacetilase.

Estas enzimas são codificadas por genes estruturais.

Para além de os três genes serem adjacentes no mesmo cromossoma, eles são também transcritos num único RNA. Mas, enquanto não houver lactose no meio, esses genes não são expressos.

No processo de regulação negativa, em operões como o da lactose, e na ausência de substrato, uma proteína repressora (produzida na forma activa) liga-se ao operador, impedindo que a RNA polimerase se ligue ao promotor, de tal forma que a transcrição não ocorre. Esta proteína repressora resulta do chamado gene regulador (ou gene l ou lac l), situado próximo dos genes estruturais.
O repressor liga-se a uma região do DNA próxima do gene que codifica para a -galactosidase e perto do ponto em que se inicia a transcrição do RNA. É a especificidade do repressor (o repressor tem a capacidade de reconhecer uma sequência específica de DNA, ou seja, um operador específico) que determina que este se ligue ao ponto no DNA próximo do gene que ele controla, e não noutro local ao longo do cromossoma.
Estando o repressor ligado ao operador é impedida a transcrição do DNA pela RNA polimerase.

Derivados da lactose, ou a própria lactose, podem ligar-se ao repressor, alterando a sua configuração. Assim, este deixa de ter afinidade com o operador, e permite a ligação da RNA polimerase ao promotor, possibilitando a transcrição do operão.

Operão triptofano em procariontes

A síntese de triptofano surge relacionada com um mecanismo repressivo. Quando o triptofano está presente na célula liga-se à proteína repressora (que é produzida na sua forma inactiva) activando-a. O complexo formado pelo triptofano e pelo repressor liga-se ao operador, impedindo a transcrição dos genes responsáveis pela produção ds enzimas.

Na ausência de triptofano, o gene operador fica livre podendo a RNA polimerase ligar-se o promotor e proceder à transcrição dos genes, originando depois, as enzimas necessárias à síntese de triptofano.

Quanto ao sangue...

Quanto ao nosso tipo de sangue, para sua determinação, têm-se em consideração dois sistemas distintos - sistema ABO e sistema Rhesus.

Em primeiro lugar convém ilucidar que existem genes para os quais se têm mais de duas formas alélicas, ou seja, para mesma característica existem mais de duas formas alternativas - alelos múltiplos.

Sistema ABO

No sistema ABO, tal como o próprio nome indica existem três alelos para a mesma característica. Como tal existem desde logo três fenótipos possíveis, no entanto ainda se verifica co-dominância entre A e B.

É possível, então, distinguir quatro tipos de grupos sanguíneos (A, B, AB e O), cuja classificação se baseia essencialmente nos tipos de aglutinogénios (ou antigenes) presentes nas hemácias.

A=B

A>O

B>O

No plasma existem aglutininas (anticorpos) compatíveis com os aglutinogénios das hemácias.

Por exemplo, quando o aglutinogénio A está presente nas hemácias, não pode existir no plasma a aglutinina anti-A, porque desencadear-se-ia uma reacção de aglutinação nas hemácias.

Da mesma forma, hemácias com o aglutinogénio B reagirão com aglutininas anti-B.

Estas descobertas levaram à formulação da "Lei de Landsteiner", segundo a qual no plasma de pessoas do grupo A, estão presentes aglutininas anti-B; no plasma de indivíduos do grupo B existem aglutininas anti-A; os indivíduos do grupo AB não possuem nenhumas das aglutininas e os indivíduos do grupo O possuem os dois tipos de aglutininas.

Sistema Rhesus

O factor Rhesus ou Rh é um antigene localizado na superfície das hemácias e que, como resposta imunitária induz a produção de um anticorpo: anti-Rh.

Os indivíduos que possuem este antigene denominam-se Rh+ e podem ser homozigóticos (Rh+Rh+) ou heterozigóticos (Rh+Rh-), e não possuem aglutininas anti-Rh.

Os indivíduos que não possuem o factor Rhesu denominam-se Rh- e são homozigóticos (Rh-Rh-) e geralmente possuem aglutininas anti-Rh.

Quanto a transfusões estas informações devem, então, ser tidas em consideração. O receptor universal, quanto ao sistema ABO é o tipo AB uma vez que não possui aglutininas; quanto ao dador universal é o tipo O.

No sistema Rhesus apenas os indivíduos Rh+ podem receber de qualquer dador (Rh+ ou Rh-), sendo que existem já precauções tomadas em situações como partos de mães Rh- que dão à luz filhos Rh+ uma vez que a vida de um próximo filho estaria posta em risco, pois no organismo materno formam-se anticorpos anti-Rh aquando do contacto do sangue da mãe com o sangue do bebé (eritroblastose fetal).

HEREDITARIEDADE HUMANA

Hereditariedade Autossómica

Consiste na transmissão de características cujos genes se situam nos autossomas, ou cromossomas somáticos.

Pode considerar-se a transmissão autossómica recessiva e a transmissão autossómica dominante.

A transmissão hereditária de um alelo autossómico recessivo caracteriza-se por:

• Os homens e as mulheres são igualmente afectados;


• A anomalia não aparece em todas as gerações;


• Dois progenitores fenotipicamente normais poderem originar descendentes afectados;


• Dois progenitores afectados originam toda a descendência afectada também;


• Os indivíduos heterozigóticos não manifestam a característica.

Exemplos de doenças transmitidas desta forma são a fenilcetonúria e o albinismo.

A transmissão hereditária de um alelo autossómico dominante caracteriza-se por:

• Os homens e as mulheres são igualmente afectados;

• A anomalia tende a manifestar-se em todas as gerações;

• Não ocorrem descendentes com a anomalia quando ambos os progenitores são normais;

• Quando um indivíduo manifesta a anomalia, pelo menos um dos progenitores também a possui;

• Quando um dos elementos do casal tem a anomalia, aproximadamente metade da sua descendência pode ser afectada;

• Indivíduos hererozigóticos manifestam a carcterística.

Exemplos de doenças transmitidas desta forma são a polidactilia e a doença de Huntington.

Hereditariedde ligada ao Sexo

caracteriza-se por:

• na mulher, um alelo recessivo só se manifesta em caso de homozigotia;

• no homem, o alelo presente no cromossoma X manifesta-se, seja recessivo ou dominante;

• é, então, mais frequente manifestar-se uma característica recessiva num homem do que numa mulher.

Exemplos deste tipo de transmissão hereditária são o daltonismo e a hemofilia (ambas recessivas).