A Reacção de Polimerização em Cadeia (PCR) é uma técnica de Biologia Molecular que permite replicação in vitro do DNA de forma extremamente rápida. Com a PCR, quantidades mínimas de material genético podem ser amplificadas milhões de vezes em poucas horas, permitindo a detecção rápida e fiável dos marcadores genéticos de doenças infecciosas, cancro ou doenças genéticas.
O uso da tecnologia de Reacção de Polimerização em Cadeia aumentou enormemente a capacidade dos cientistas para estudar o material genético. Desde a sua invenção por cientistas da Cetus Corporation em 1983, a PCR mudou a forma como se realiza investigação e diagnóstico médico. A capacidade de produzir rapidamente grandes quantidades de material genético permitiu avanços científicos significativos em todas as áreas de investigação genómica. A tecnologia de PCR influenciou ainda significativamente as áreas de diagnóstico e seguimento de doentes, em particular nas áreas de HIV/SIDA e Hepatite C.
Para que este processo de amplificação ocorra respeitam-se essencialmente 3 fases, que em conjunto se designam como um ciclo que se repete um número específico de vezes:
1ª fase -> Aquece-se o DNA para separar as duas cadeias de DNA (95ºC).Os dois filamentos ou cadeias de DNA são mantidos juntos por ligações de hidrogénio que, por serem relativamente fracas, quebram-se a altas temperaturas, ao passo que as ligações entre as moléculas de fosfato e desoxirribose, por serem ligações covalentes mais fortes, permanecem intactas. -> DESNATURAÇÃO
2ª fase -> O objectivo da PCR não é replicar a cadeia inteira de DNA, mas apenas replicar a sequência de interesse (normalmente com tamanhos entre 100 e 600 pares de bases) que é única no organismo. Os iniciadores (ou primers) marcam as extremidades da sequência alvo: estes iniciadores são curtas sequências sintéticas de nucleótidos, entre 20 e 30 bases. Numa reacção de PCR são incluídos dois primers, um para cada cadeia simples de DNA que foi produzida durante o passo de desnaturação. O início da sequência de DNA alvo é marcada pelos primers que se ligam (hibridizam) com a sequência complementar. Temperatura a que ocorre: normalmente entre 40 ºC e 65 ºC, dependendo do comprimento dos primers e da sua sequência. A escolha criteriosa desta temperatura permite que estas sequências iniciadores se liguem à sequência alvo com elevada especificidade. -> HIBRIDIZAÇÃO
3ª fase -> Após a ligação dos primers ou iniciadores às sequências complementares de DNA, a temperatura eleva-se a aproximadamente 72 ºC e a DNA polimerase* replica a cadeia de DNA. O processo de síntese é iniciado numa zona com cadeia dupla (onde estão ligados os primers), incorporando os nucleótidos complementares à sequência alvo. A extensão inicia-se sempre no extremo 3’ do primer, criando uma cadeia dupla a partir de cada uma das cadeias simples. -> EXTENÇÃO
Este processo tem lugar num termociclador, um equipamento que automaticamente controla e alterna as temperaturas durante períodos programados de tempo para o número apropriado de ciclos de PCR (geralmente entre 30 e 40 ciclos).
* É de salientar que a DNA polimerase que se utiliza nesta técnica é retirada de bactérias que vivem em locais muito quentes, pois de outra forma, a sensibilidade desta enzima à temperatura poderia pôr em causa todo o processo. A Taq polimerase, por exemplo, é uma polimerase de DNA termo-estável recombinante do organismo Thermus aquaticus, que, ao contrário de outras polimerases, se mantém activa a temperaturas elevadas.
Fontes:
SILVA, Amparo Dias da; SANTOS, Maria Ermelinda; MESQUITA, Almira Fernandes; BALDAIA, Ludovina; FÉLIX, José Mário; Terra, Universo de Vida; Porto: PortoEditora, 2009.
A técnica do DNA fingerprinté muito utilizada na investigação criminal e forense, pois permite não só a identificação de material biológico, mas também de cadáveres, e possibilita ainda a comparação de "impressões digitais genéticas" de progenitores e descendentes, a fim de confirmar, ou não, a paternidade.
No que consiste esta técnica?
A técnica DNA Fingerprint consiste em identificar porções de DNA.
Cada indivíduo possui o seu próprio DNA, que é único. No seio do DNA encontram-se zonas de restrição - sequências que se repetem ao longo da molécula - cujo número, tamanho e localização variam de indivíduo para indivíduo.
O DNA, quando sujeito a enzimas de restrição, fragmenta-se em diferentes porções, que se agrupam de acordo com o seu tamanho. Estas porções, como são sensíveis aos raios-X, são marcadas com um mecanismo radioactivo que permite que estas sejam detectadas. Depois, os pedaços de DNA são sujeitos a electroforese e revelam um "código de barras genético" que é característico de cada indivíduo.
Que resultado se obtém?
A partir desta técnica obtém-se, então, um padrão de bandas pretas que representam sequências de DNA, diferente de pessoa para pessoa. Comparando as bandas pertencentes a vários indivíduos é possível, por exemplo, confirmar a paternidade de uma criança.
Fontes:
SILVA, Amparo Dias da; SANTOS, Maria Ermelinda; MESQUITA, Almira Fernandes; BALDAIA, Ludovina; FÉLIX, José Mário; Terra, Universo de Vida; Porto: PortoEditora, 2009.
A Engenharia Genética é um conjunto de técnicas que permite aos cientistas identificar, isolar e multiplicar genes de quaisquer organismos. Estas técnicas incluem a cultura de células, o uso de isótopos radioactivos, a clonagem molecular, a tecnologia do DNA recombinante e o aperfeiçoamento de várias técnicas com enzimas. O objectivo é introduzir novas características em indivíduos, para seu próprio proveito ou para servir outros organismos. São exemplos disso:
a modificação do genoma de uma planta tornando-a resistente a um herbicida;
o isolamento, extração e o enxerto de gene humano para a produção de insulina em bactérias da espécie Escherichia coli, que, contendo o gene humano, multiplicam-se quando cultivadas em laboratórios, produzindo insulina, o que actualmente é realizado em grande escala
Falando de Enzimas...
A descoberta das enzimas de restrição foi um dos contributos de maior importância para o desenvolvimento da Engenharia Genética. Estas são consideradas a primeira "ferramenta" da Engenharia Genética.
A função destas enzimas, e perceber-se-á a sua elevada importância, é cortar a cadeia dupla de DNA em zonas específicas, cada vez que as encontram.
Os vírus invadem frequentemente as bactérias e afectam o seu DNA. Algumas bactérias têm como mecanismo de defesa as endonucleses de restrição, ou seja, as enzimas que cindem a cadeia dupla de DNA (no sentido 5'-3') sempre que encontram uma determinada sequência de pares de bases - zonas de restrição. ( Portanto, cada tipo de enzima de restrição corta uma região específica do DNA.) Estas enzimas procedem, assim, à fragmentação do DNA viral, desactivando-o.
Estas enzimas, como já foi dito, cortam o DNA sob a forma de hélice dupla, com uma extensão em cada uma das extremidades de DNA em cadeia simples - extremidades coesivas.
Estas extremidades coesivas podem ligar-se, por complementaridade, a outro DNA. Neste processo intervêm as DNA ligases que catalizam o processo de ligação de DNA.
Com a descoberta das enzimas de restrição e das DNA ligases os cientistas tinham ao seu dispor todo o material necessário para transferir genes de uma molécula de DNA para outra, e consequentemente de um organismo para outro.
Necessitavam apenas de um elemento de transferência do material genético de um genoma para outro - vector.
Vetores utilizados em Engenharia Genética
Plasmídeo bacteriano
As bactérias, em particular a Escherichia coli, constituem um dos principais materiais biológicos empregados nas técnicas da Engenharia Genética. Isto deve-se a vários fatores: - ciclo de vida rápido em relação aos organismos superiores; -cultivo de um grande número de indivíduos num espaço pequeno; - apresenta menor número de genes em relação aos organismos superiores; - divisão celular por bipartição. Além do DNA cromossómico, a célula bacteriana contém pequenas moléculas de DNA circular denominadas plasmídeos. Estes mantêm uma existência independente do DNA essencial à vida da bactéria; no entanto, a sua duplicação é sincronizada com a da bactéria, garantindo assim sua transmissão para as bactérias-filhas. Em Engenharia Genética, genes "estranhos" na bactéria podem ser incorporados nos seus plasmídeos, e assim, tais bactérias passam a produzir as proteínas que esses genes codificam. Certos plasmídeos possuem genes responsáveis pela síntese de enzimas que destroem um antibiótico antes mesmo que ele faça mal a bactéria. Os plasmídios portadores de genes que conferem resistência a drogas são chamados PLASMÍDEOS R (R Resistência). Eles possuem também, genes que permitem a sua passagem de uma bactéria para outra (RTF ou Fator de Transferência de Resistência). Quando dois ou mais tipos de plasmídios R estão presentes numa mesma bactéria, os genes de um deles podem passar para o outro. Esse mecanismo faz com que surjam plasmídios R muito complexos, portadores de diversos genes para resistência a diferentes antibióticos.
Vírus
Os vírus, principalmente o bacteriófago, são de grande utilidade na Tecnologia do DNA Recombinante. O bacteriófago possui genes essenciais que são indispensáveis à reprodução, e também genes não essenciais, cuja presença é dispensável à multiplicação viral. Os genes essenciais produzem as proteínas da cápsula e as enzimas que actuam na duplicação do DNA viral. Esses genes estão localizados nas extremidades do cromossoma do vírus. Entretanto, os genes não essenciais estão relacionados com os processos de recombinação entre moléculas de DNA, e localizam-se na região mediana do cromossoma viral, sem interferir na reprodução do vírus, sendo portanto dispensáveis.
A região mediana do cromossoma, onde se localizam os genes dispensáveis, pode ser retirada e substituída por um pedaço de DNA de outro organismo. Sendo assim, quando o cromossoma viral se multiplica, o DNA estranho incorporado a ele também será multiplicado. Os cientistas têm utilizado essa técnica para conseguir a multiplicação de genes importantes a fim de obter grande número de cópias, o que é necessário ao estudo de genes.
Lipossomos
São essencialmente esferas de membrana sintética formadas por camadas bilipídicas preenchidas com DNA. Eles fundem-se espontaneamente com a membrana celular, liberando o seu conteúdo no citoplasma. Apresentam a vantagem de nunca causar doença alguma, porém apresentam pouca eficiência.
Técnica do DNA Recombinante
Em Engenharia Genética a expressão DNA Recombinante designa o resultado obtido a partir de pedaços de DNA de fontes diferentes ligados entre si. Às vezes, o DNA provém de dois organismo diferentes, como é o caso do gene para insulina ligado ao DNA da bactéria. Outras vezes, um pedaço de DNA de um organismo pode ser ligado a um DNA sintético produzido em laboratório pela junção de nucleótidos na sequência desejada. Para se conseguir DNA recombinante é preciso cortar as moléculas de DNA que se quer recombinar e em seguida, "colar" as suas extremidades. Para isso, os pesquisadores contam com ferramentas extremamente úteis: enzimas de restrição. Essas enzimas são obtidas de bactérias que as produzem naturalmente para se defenderem da invasão de alguns vírus.
1º passo: obter genes para o enxerto pretendido, para isso pode-se:
criar uma biblioteca de genes, que consiste no armazenamento de um grande número de fragmentos de DNA do genoma que são armazenados em vectores;
fabricar o gene em laboratório a partir de RNA mensageiro (técnica do DNA complementar*);
sintetizar o gene, nucleótido por nucleótido. Isso é feito normalmente para genes que codificam polipeptídeos ou proteínas de pequeno tamanho. Suponha-se que se conhece a sequência de aminoácidos de um pequeno polipeptídeo. Cada aminoácido é codificado por uma sequência de três nucleótidos de DNA - codão. Basta utilizar a tabela do código genético já conhecida para ser possível construir uma sequência de nucleótidos que corresponda exactamente à sequência de aminoácidos da proteína.
2º passo: acção das enzimas de restrição, isolando o gene que se pretende manipular.
3º passo: incorporação do gene num vector, utilizando-se o mesmo tipo de enzima de restrição utilizado no passo anterior, ma agora no vector.
4º passo: inserção do vector numa célula bacteriana.
5º passo: verificação do resultado. No caso da bactéria absorver o DNA recombinante poderão obter-se imensas cópias - clones - desta.
*Técnica do DNA complementar (cDNA)
Consiste na produção de uma molécula de DNA (cadeia simples) tendo como molde uma molécula de mRNA matura, por complementaridade de bases.
A produção do cDNA é possível por acção da enzima transcriptase reversa. O mRNA é molde para a síntese de uma cadeia de DNA, o processo inverso do que ocorre habitualmente na transcrição.
Após a formação da primeira cadeia de cDNA, a DNA polimerase forma a cadeia complementar, constituindo-se uma cadeia de DNA em dupla hélice, estável.
Curiosidade:
A comparação entre o cDNA (sem intrões) e o DNA original permite localizar as regiões codificantes (exões) e as não codificantes (intrões) de um determinado gene.
O cDNA facilita a produção de proteínas de seres eucariontes em bactérias, uma vez que estas não posuem mecanismos de processamento do mRNA, isto é, em presença de um DNA original transcreveriam todo o gene, incluindo os intrões, obtendo-se proteínas diferentes das que se pretendiam.
Ao ser inserido um clone decDNA garante-se a produção da proteína normal.
Fontes:
SILVA, Amparo Dias da; SANTOS, Maria Ermelinda; MESQUITA, Almira Fernandes; BALDAIA, Ludovina; FÉLIX, José Mário; Terra, Universo de Vida; Porto: PortoEditora, 2009.
A palavra assusta, é dura. Facto explicável apenas pela carga emocional, pelo peso do medo, pelo horror da proximidade que cada um de nós associa a esta pequena palavra - cancro.
Aqui não se pretendem abordar os sentimentos ou as viências de alguém que conviva com um cancro, pretende-se sim explicar, na teoria, o porquê de estas "pedras no caminho" de tanta gente aparecerem assim, tanto e sem aviso.
Proto-oncogenes -> genes que estimulam a divisão celular e participam activamente na regulação da proliferação e diferenciação das células.
Oncogenes -> genes que foram alterados por acção de agentes mutagénicos (de origem química, física ou biológica) - mutados - e que por passarem a estimular continuamente a divisão celular podem conduzir à formação de um tumor.
Genes supressores tumorais -> comparativamente aos proto-oncogenes são genes intimamente ligados à divisão celular, no entanto com função contrária - inibindo a divisão celular. Estes genes podem sofrer mutações e perder a sua função, descontrolando-se assim a divisão das células.
Mas afinal como aparecem?
Todos os cancros são genéticos, pois todos resultam de alterações no material genético do indivíduo, no entanto, cancros hereditários são muito poucos.
A acumulação de mutações leva à formação do tumor, que se estende aos tecidos circundantes devido ao descontrole da divisão celular - metastase.
A maioria dos cancros são cancros esporádicos, que surgem como resultado de mutações somáticas (devidas a agentes mutagénicos externos).
Fontes: SILVA, Amparo Dias da; SANTOS, Maria Ermelinda; MESQUITA, Almira Fernandes; BALDAIA, Ludovina; FÉLIX, José Mário; Terra, Universo de Vida, Porto: PortoEditora, 2009
A Trissomia 21, ou Síndrome de Down, é uma alteração genética, que ocorre durante a divisão das células do embrião.
O indivíduo com Trissomia 21 possui 47 cromossomas (e não 46), sendo o cromossoma extra ligado ao par 21.
Intimamente ligada a um excesso de material cromossómico, este distúrbio no cariótipo do embrião tem nítida relação com a idade dos pais.
As estatísticas dizem-nos que um em cada 800 a 1000 recém-nascidos são portadores de trissomia 21, um distúrbio genético causado pela presença de três cópias do cromossoma 21 em vez do habitual par de homólogos.
A Síndrome de Down está normalmente associada a dificuldades no âmbito do desenvolvimento físico e das capacidades cognitivas, assim como a diferenças na aparência facial e corporal.
Enquanto no início da década de trinta, a esperança de vida para uma pessoa com trissomia 21 era de nove anos, hoje pode ter uma vida longa e saudável.
Algumas das características dos portadores de Síndrome de Down são: a prega palmar transversa (uma única prega, em vez de duas), olhos com formas diferenciadas devido às pregas nas pálpebras, membros pequenos, pescoço curto e largo e língua exposta.
Os afectados pela síndrome de Down possuem maior risco de sofrer defeitos cardíacos congénitos, otites recorrentes, apneia de sono obstrutiva e disfunções da glândula tiróide, entre outras.
Como é possível que depois de todas estas "condicionantes genéticas" ainda existam o preconceito e a vergonha por parte da sociedade a atormentar a vida destas pessoas? Afinal, têm apenas mais um cromossoma que o comum, o cromossoma do AMOR como tantas vezes é descrito... Sejamos pessoas.
Fontes:
SILVA, Amparo Dias da; SANTOS, Maria Ermelinda; MESQUITA, Almira Fernandes; BALDAIA, Ludovina; FÉLIX, José Mário; Terra, Universo de Vida, Porto: PortoEditora, 2009
O fenótipo dos indivíduos é o resultado da interacção genoma - ambiente.
A célula tem capacidade para reparar anomalias que afectam o DNA mas algumas presistem e alteram o genoma.
Então, devido a variados factores, o genoma dos individuos sofre alterações, que se denominam mutações.
Muitas vezes estas mutações ocorrem de forma espontânea como resultado de agentes mutagéncos internos ou externos ao organismo.
Tendo em conta que os milhões de células que constituem o nosso organismo estão em constante divisão, admite-se que a possibilidade de erro durante algum dos processos decorrentes da vida celular é elevadíssimo. Este facto seria uma fatalidade não tivessem as células, como já referido, uma extraordinária capacidade para reparar estas anomalias (aliada ainda às mutações silenciosas).
Mutações Génicas -> envolvem uma alteração pontual ao nível dos nucleótidos de um gene.
Existem três tipos de mutações génicas, estas são ilustradas pelas seguintes imagens:
Mutações Cromossómicas -> envolvem a estrutura ou o número de cromossomas de um indivíduo.
As mutações cromossómicas dividem-se em dois tipo: estruturais e numéricas. Nas mutações cromossómicas estruturais têm-se:
Nas mutações cromossómicas numéricas constam da alteração do número normal de cromossomas no indivíduo.
Euploidia: o cariótipo apresenta o número de cromossomas característico.
Aneuploidia: o cariótipo, num determinado par de homólogos apresenta irregularidades, por excesso ou defeito, no número de cromossomas.
Poliplodia: todo o conjunto de cromossomas é multiplicado.
Fontes: SILVA, Amparo Dias da; SANTOS, Maria Ermelinda; MESQUITA, Almira Fernandes; BALDAIA, Ludovina; FÉLIX, José Mário; Terra, Universo de Vida, Porto: PortoEditora, 2009
complementares de DNA, a temperatura eleva-se a aproximadamente 72 ºC e a DNA polimerase* replica a cadeia de DNA. O processo de síntese é iniciado numa zona com cadeia dupla (onde estão ligados os primers), incorporando os nucleótidos complementares à sequência alvo. A extensão inicia-se sempre no extremo 3’ do primer, criando uma cadeia dupla a partir de cada uma das cadeias simples. -> EXTENÇÃO
complementares de DNA, a temperatura eleva-se a aproximadamente 72 ºC e a DNA polimerase* replica a cadeia de DNA. O processo de síntese é iniciado numa zona com cadeia dupla (onde estão ligados os primers), incorporando os nucleótidos complementares à sequência alvo. A extensão inicia-se sempre no extremo 3’ do primer, criando uma cadeia dupla a partir de cada uma das cadeias simples. -> EXTENÇÃO
