Reacções de polimerização em cadeia (PCR)
Posted on 20:08 by Paulinha e Suzi
A Reacção de Polimerização em Cadeia (PCR) é uma técnica de Biologia Molecular que permite replicação in vitro do DNA de forma extremamente rápida. Com a PCR, quantidades mínimas de material genético podem ser amplificadas milhões de vezes em poucas horas, permitindo a detecção rápida e fiável dos marcadores genéticos de doenças infecciosas, cancro ou doenças genéticas.
O uso da tecnologia de Reacção de Polimerização em Cadeia aumentou enormemente a capacidade dos cientistas para estudar o material genético. Desde a sua invenção por cientistas da Cetus Corporation em 1983, a PCR mudou a forma como se realiza investigação e diagnóstico médico. A capacidade de produzir rapidamente grandes quantidades de material genético permitiu avanços científicos significativos em todas as áreas de investigação genómica. A tecnologia de PCR influenciou ainda significativamente as áreas de diagnóstico e seguimento de doentes, em particular nas áreas de HIV/SIDA e Hepatite C.
Para que este processo de amplificação ocorra respeitam-se essencialmente 3 fases, que em conjunto se designam como um ciclo que se repete um número específico de vezes:
1ª fase -> Aquece-se o DNA para separar as duas cadeias de DNA (95ºC).Os dois filamentos ou cadeias de DNA são mantidos juntos por ligações de hidrogénio que, por serem relativamente fracas, quebram-se a altas temperaturas, ao passo que as ligações entre as moléculas de fosfato e desoxirribose, por serem ligações covalentes mais fortes, permanecem intactas. -> DESNATURAÇÃO
2ª fase -> O objectivo da PCR não é replicar a cadeia inteira de DNA, mas apenas replicar a sequência de interesse (normalmente com tamanhos entre 100 e 600 pares de bases) que é única no organismo. Os iniciadores (ou primers) marcam as extremidades da sequência alvo: estes iniciadores são curtas sequências sintéticas de nucleótidos, entre 20 e 30 bases. Numa reacção de PCR são incluídos dois primers, um para cada cadeia simples de DNA que foi produzida durante o passo de desnaturação. O início da sequência de DNA alvo é marcada pelos primers que se ligam (hibridizam) com a sequência complementar. Temperatura a que ocorre: normalmente entre 40 ºC e 65 ºC, dependendo do comprimento dos primers e da sua sequência. A escolha criteriosa desta temperatura permite que estas sequências iniciadores se liguem à sequência alvo com elevada especificidade. -> HIBRIDIZAÇÃO
3ª fase -> Após a ligação dos primers ou iniciadores às sequências
complementares de DNA, a temperatura eleva-se a aproximadamente 72 ºC e a DNA polimerase* replica a cadeia de DNA. O processo de síntese é iniciado numa zona com cadeia dupla (onde estão ligados os primers), incorporando os nucleótidos complementares à sequência alvo. A extensão inicia-se sempre no extremo 3’ do primer, criando uma cadeia dupla a partir de cada uma das cadeias simples. -> EXTENÇÃO
complementares de DNA, a temperatura eleva-se a aproximadamente 72 ºC e a DNA polimerase* replica a cadeia de DNA. O processo de síntese é iniciado numa zona com cadeia dupla (onde estão ligados os primers), incorporando os nucleótidos complementares à sequência alvo. A extensão inicia-se sempre no extremo 3’ do primer, criando uma cadeia dupla a partir de cada uma das cadeias simples. -> EXTENÇÃOEste processo tem lugar num termociclador, um equipamento que automaticamente controla e alterna as temperaturas durante períodos programados de tempo para o número apropriado de ciclos de PCR (geralmente entre 30 e 40 ciclos).
* É de salientar que a DNA polimerase que se utiliza nesta técnica é retirada de bactérias que vivem em locais muito quentes, pois de outra forma, a sensibilidade desta enzima à temperatura poderia pôr em causa todo o processo. A Taq polimerase, por exemplo, é uma polimerase de DNA termo-estável recombinante do organismo Thermus aquaticus, que, ao contrário de outras polimerases, se mantém activa a temperaturas elevadas.
Fontes:
SILVA, Amparo Dias da; SANTOS, Maria Ermelinda; MESQUITA, Almira Fernandes; BALDAIA, Ludovina; FÉLIX, José Mário; Terra, Universo de Vida; Porto: PortoEditora, 2009.
Introdução à PCR; 20/01/2010; <http://www.roche.pt/portugal/index.cfm/produtos/equipamentos-de-diagnostico/products/molecular-diag/intro-pcr/>
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